一氧化氮测定试剂盒 (A013-2)

[预期应用]

本试剂盒可测血清、血浆、组织样本和其它生物液体中N0含量。

一氧化氮NO (即血管内皮舒张因子)，在生物体内作为种反应性极强的自由基，兼有第二信使和神经递质作用，同时又是一种效应分子，在体内县有广泛的生理作用，如松弛血管平滑肌、抑制血小板聚集、调节脑血流、介导细胞毒效应和免疫调节、参与学习和记忆、动脉粥样硬化等作用。NO产生异常与某些疾病的发生发展有着密切关系。因此，近年来对NO的研究越来越受到广大科学工作者的重视。

[试剂盒内容]

临测定前，用双蒸馏水将2mmol/L标准溶液稀释至20μmol/L。 

[试剂盒的储存及有效期]

1. Reagent 1：4^oC可保存6个月。              

1. Reagent 2：4^oC可保存6个月。              

2. Reagent 3：4^oC避光可保存6个月。             

3. Reagent 4：4^oC避光可保存6个月。            

4. Reagent 5：4^oC保存6个月。              

5. 2mmol/LSodium nitrite标准品：4^oC保存6个月。

[试剂准备]

1. 显影剂：R3:R4:R5= 2.5:1:1，临用前制备，在4^oC存储，当颜色加深时不能使用。

2. 标准：用蒸馏水稀释2 mmol/L亚硝酸钠标准，分别为1:39、1:79、1:99、1:159、1:319、1:639，制备0.05mmol/L、0.025mmol/L、0.02mmol/L、0.0125mmol/L、0.00 625mmol/L、0.00 3125mmol/L标准溶液。

[标本处理]

1. 血清

取血清直接用于实验。

2. 组织样本

动物组织：取适量组织样本，称重，按比例加入生理盐水制备组织匀浆（质量体积比=1：9，例如900μl生理盐水中加入100μg组织），2500～3000 0rp/min离心10分钟，取上清液用于实验。

植物组织：取适量组织样本，称重，按比例加入 0.1mol/L PBS（pH7~7.4）制备组织匀浆（质量体积比=1：9，例如900μl0.1mol/L PBS（ pH7~7.4）中加入100μg组织），4000rpm/min离心10分钟，取上清液用于实验。

细胞样本：用六孔板培养细胞，若要测定细胞培养上清中的总蛋白含量，则应直接检测；若要确定细胞的总蛋白含量，则用胰蛋白酶消化细胞（或直接刮取细胞），收集细胞和液体于试管内，1000～3000 rpm/min离心5分钟，弃上清液。在沉淀中加入1ml生理盐水，混匀（洗脱胰蛋白酶原和培养液），1000～3000 rpm/min 离心5分钟，弃上清液并保存沉淀细胞，加入0.2～0.3mL生理盐水制备匀浆液（有以下4种匀浆方法）：a. 细胞裂解液；b. 超声处理；c. 摇晃； d玻璃匀浆器，每次研磨5～10秒，研磨3～4次，每次间隔20秒，取匀浆用于实验。

注：取样前摇匀。

[操作步骤]

1. 标准品预处理

用蒸馏水稀释2 mmol/L Sodium nitrite 标准，稀释倍数分别为1:39、1:79、1:99、1:159、1:319、1:639，制备0.05mmol/L、0.025mmol/L、0.02mmol/L、0.0125mmol/L、0.00625mmol/L、0.003125mmol/L标准溶液。

2. 样本预处理

血清(血浆):

取100μl 血清(血浆)， 加200μl Reagent 1 , 混匀，加100μl Reagent 2,漩涡充分混匀后静置10分钟，3500~4000rpm/min离心15分钟，取上清液160μl 用于实验。

组织匀浆：取300μl 10%匀浆上清液，加200μl Reagent 1 , 混匀，加100μl Reagent 2, 漩涡充分混匀后静置10分钟，3500~4000rpm/min离心15分钟，取上清液160μl 用于实验。

3. 操作表

[实验原理]

NO本身半衰期极短，血液中的NO主要由血管内皮细胞、血管平滑肌细胞、血小板、巨噬细胞等产生以亚硝酸盐及硝酸盐的形式存在，通过其浓度可以间接测定NO浓度。

[说明]

1. 严格按照说明书进行操作。

2. 上清液需澄清，若混浊，建议再次离心。

3. 血清样本出现溶血和浑浊会影响结果。

4. 血液和组织在4～5℃可保存3天，温度越低，保存时间越长。在-20℃下可保存1～2个月。

5. 请参考血清（血浆）检测培养液并计算。

6. 细胞培养上清样本测算请参考血清血浆样本。

[下载]

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