免疫组化辅助试剂包（两步法）

[产品信息]

通过辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗（抗抗体）与结合在组织片上的一抗特异性结合形成免疫复合物。位于聚合物上HRP会催化底物H₂O₂与DAB反应，最终形成棕褐色不溶性色原，特异性的将免疫原在组织和细胞中标定出来，通过显微镜观察确定免疫原的最终位点。

[试剂组分] 

[备选指标]

[适用范围]

本产品仅用于免疫组化实验，适用于手工和机器大批量操作。本试剂仅对10%中性缓冲福尔马林固定石蜡包埋的组织进行了验证，不作其他用途。

[储存及有效期]

2～8℃避光保存，不得冻存；产品有效期为6个月。

[实验操作]

1、完成IHC实验还要的设备和试剂

   a)、移液器、恒温箱、修复仪、免疫组化笔、计时器、孵育盒、染色架、盖玻片、光学显微镜、洗瓶。

   b)、DAB显色液：利用显色剂稀释DAB显色液到工作液浓度，现配现用。

   c)、pH 6.0，0.01M枸橼酸钠抗原修复液：利用双蒸水稀释到工作液浓度使用。

2、实验步骤

（1）烘片：铅笔标记用于区分石蜡切片，65℃，1-2h。

（2）脱蜡至水：烘片结束，石蜡切片依次于二甲苯I 30min，二甲苯II 30min，100%、100%、95%、80%、70%的乙醇中各10min，再放入纯水里10min。

（3）抗原修复。高温高压法和微波法自选。

      高温高压法：压力锅中加入pH 6.0 ，0.01M枸橼酸钠抗原修复液约1000ml，切片插入塑料架上，放入压力锅，盖上锅盖（此时不扣上压力阀）1600W预热至沸腾，扣上压力阀1300W，待高压锅阀门喷气开始计时，修复时间为2分钟。

      微波法：取一定量pH 6.0 ，0.01M枸橼酸钠抗原修复液，加入微波盒中，微波加热至沸腾，将脱蜡水化后的组织切片置于耐高温塑料切片架上，放入已沸腾的缓冲液中，微波低火处理3分钟，放置8分钟后低火3分钟，取出微波盒流水自然泠却，从缓冲液中取出玻片，先用蒸馏水冲洗两次，之后用PBS冲洗3分钟×3次。

（4）阻断内源性过氧化物酶。加入适量的内源性过氧化物酶阻断剂，室温孵育10分钟；PBS缓冲液冲洗3分钟×3次。

（5）非特异性位点的封闭：甩去残夜，滴加封闭血清工作液覆盖切片，约200ul/片，室温孵育20min。

（6）滴加一抗。根据组织大小，滴加100μL或适量的一抗，37℃孵育60分钟；PBS缓冲液冲洗3分钟×3次。

（7）根据实验物种的差异选择合适的HRP标记抗IgG聚合物，滴加100μL或适量的HRP标记抗IgG聚合物，37℃孵育30分钟；PBS缓冲液冲洗3分钟×3次。

（8）显色。加入适量新鲜配制的DAB，室温孵育30秒-5分钟，根据显微镜下着色情况终止反应。

（9）复染。自来水冲洗，苏木素染色液孵育2分钟；滴加1%盐酸酒精分色1秒、PBS冲洗返蓝。

（10）脱水、透明、封片。

（11）显微镜观察，拍照。

[注意事项]

1、在每一次染色过程中，必须有空白对照和阴性对照实验同时进行。

2、如果阳性组织对照不能显示适当的阳性染色，应判定该批次样本的检测结果无效。

3、若HRP标记IgG聚合物孵育温度过高或孵育时间过长，可能导致染色过强及背景染色。

4、红细胞和细胞色素 C可能会造成假阳性结果。

5、脱蜡不彻底，容易影响染色效果，建议免疫组化切片脱蜡与常规HE脱蜡分开。

6、为防止可能出现的假阳性、假阴性结果，在实验过程中需设置阳性与阴性对照。

7、实验中滴加试剂时，过多的PBS缓冲液会导致试剂被稀释，将引起染色强度变弱，因此，滴加试剂前应除去多余的缓冲液。

8、在实验操作过程中，请穿戴好手套、眼镜和实验服，以及依照相应的实验流程，做好防护措施。