荧光定量PCR实验报告-组织样本
一、实验器材及试剂
1、 实验器材
名称 | 厂家 | 型号 |
多样品研磨珠均质仪 | Omni | Bead Ruptor 12多样品研磨珠均质仪 |
台式高速冷冻型离心机 | 湖南湘仪仪器开发有限公司 | H1850R |
荧光定量PCR仪 | Roche | LightCycler®480 II |
普通PCR仪 | 杭州晶格科学仪器有限公司 | K960 |
水浴锅 | 宁波市硕力仪器有限公司 | SKE-3S |
超净工作台 | 苏州净化设备有限公司 | SW-CJ-1D |
组织研磨仪 | 武汉塞维尔生物科技有限公司 | KZ-III-FP |
超微量分光光度计 | Thermo | NanoDrop2000 |
标准试剂型纯水仪 | 青岛富勒姆科技有限公司 | FBZ2001-up-p |
离心管 | Axygen Biosciences | |
TIP头 | Axygen Biosciences |
2、 主要实验试剂及耗材
试剂 | 厂家 | 货号 |
TRNzol Universal Reagent | 天根生化科技(北京)有限公司 | DP424 |
三氯甲烷 | 国药集团化学试剂有限公司 | 10006818 |
异丙醇 | 国药集团化学试剂有限公司 | 80109218 |
75%酒精 | 武汉市雪环医用消毒用品有限公司 | |
EasyScrpt One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix | 全式金 | AE311-03 |
Hieff™ qPCR SYBR® Green Master Mix (No Rox) | 翊圣生物 | 11201ES08 |
QPCR引物 | 通用生物系统(安徽)有限公司 |
二、荧光定量PCR实验步骤
1、组织样本总RNA抽提(枪头和离心管均经过湿热灭菌,无RNA酶)
1)取40-60mg组织,加入1ml的Trizol Reagent,在-40℃条件下放置在组织研磨仪进行研磨。
2)充分研磨直至无可见组织块。
3)加入200 μl三氯甲烷,剧烈震荡15秒使其充分混匀,液体呈乳状,室温静置3min。
4)4℃ 下12000rpm离心15min,样品会分为3层:粉色有机相,中间层和上层无色的水相,RNA主要在水相中,把水相(约500ul)转移到新的离心管中。
5)在得到的水相溶液中加入等体积异丙醇,混匀,室温放置3min。
6)4℃下12000rpm离心10min,去上清。离心前RNA沉淀是看不见的,离心后在管侧和管底形成胶状沉淀。
7)加入75%乙醇1ml洗涤沉淀,颠倒混匀数次,使沉淀悬浮。
8)4℃下12000rpm离心5min。
9)弃上清,再用小枪头吸净管底乙醇,将离心管置于超净台上吹3min,晾干沉淀(不要晾的过干,RNA完全干燥会很难熔解,大约2-3min即可)。
10)加入适量(20--50ul)的无RNA酶的水溶解RNA。
11)使用Nanodrop 2000检测RNA浓度及纯度:仪器空白调零后取2μl 待测RNA溶液于检测基座上,放下样品臂,使用电脑上的软件开始吸光值检测。
12)将浓度过高的RNA进行适当比例的稀释,使其终浓度为100ng/μl。
2、普通基因反转录
1)取一PCR管,加入含100ng RNA的溶液8ul,作为反转录的模板。
2)加入2μl 反转录引物Oligo dT。
3)用无核糖核酸酶的去离子水补足至16ul。
4)依次加入20μl 2×ES Reaction Mix ,2μl gDNA Remover,和2μl EasyScrptRT/RI Enzyme Mix,用枪抽吸混匀。
5)于放入水浴锅中43℃加热30min,结束后85℃加热5s灭活EasyScrptRT/RI与gDNA Remover。
3、定量PCR
1)取1.5ml EP管,配制如下反应体系,每个反转录产物按照如下反应体系配制3份,并将配制好的反应体系加入96孔PCR反应板中。
Hieff™ qPCR SYBR® Green Master Mix (No Rox) 10.0ul
Forward Primer 1.0μl
Reverse Primer 1.0μl
模板DNA X
ddH2O to 20.0μl
2)PCR扩增
预变性95℃,5min
循环(44次) 95℃→15s,55℃→30s,72℃→20s
熔解曲线75℃→95℃,每20s升温1℃
4、结果处理
ΔΔCT法:
A=CT(目的基因,待测样本)- CT(内标基因,待测样本)
B=CT(目的基因,对照样本)- CT(内标基因,对照样本)
K=A-B
表达倍数=2e-K