一、实验器材及试剂

1、 实验器材

2、 主要实验试剂及耗材

二、荧光定量PCR实验步骤

1、细胞样本总RNA抽提（枪头和离心管均经过湿热灭菌，无RNA酶）

1）向装有细胞的EP管中加入1ml的TRNzol Reagent，上下颠倒混匀，使其悬浮于TRNzol Reagent。

2）加入200 μl三氯甲烷，剧烈震荡15秒使其充分混匀，液体呈乳状，室温静置3min。

3）4℃ 下12000rpm离心15min，样品会分为3层：粉色有机相，中间层和上层无色的水相，RNA主要在水相中，把水相（约500ul）转移到新的离心管中。

4）在得到的水相溶液中加入等体积异丙醇，混匀，室温放置10min。

5）4℃下12000rpm离心10min，去上清。离心前RNA沉淀是看不见的，离心后在管侧和管底形成胶状沉淀。

6）加入75%乙醇1ml洗涤沉淀，颠倒混匀数次，使沉淀悬浮。

7）4℃下12000rpm离心5min。

8）弃上清，再用小枪头吸净管底乙醇，将离心管置于超净台上吹3min，晾干沉淀（不要晾的过干，RNA完全干燥会很难熔解，大约2-3min即可）。

9）加入适量（20--50ul）的无RNA酶的水溶解RNA。

10）使用Nanodrop 2000检测RNA浓度及纯度：仪器空白调零后取2μl 待测RNA溶液于检测基座上，放下样品臂，使用电脑上的软件开始吸光值检测。

11）将浓度过高的RNA进行适当比例的稀释，使其终浓度为100ng/μl。

2、普通基因反转录

1）取一PCR管，加入含100ng RNA的溶液8ul，作为反转录的模板。

2）加入2μl 反转录引物Oligo dT。

3）用无核糖核酸酶的去离子水补足至16ul。

4）依次加入20μl  2×ES Reaction Mix ，2μl  gDNA Remover，和2μl EasyScrptRT/RI Enzyme Mix，用枪抽吸混匀。

5）于放入水浴锅中43℃加热30min，结束后85℃加热5s灭活EasyScrptRT/RI与gDNA Remover。

3、定量PCR

1）取1.5ml EP管，配制如下反应体系，每个反转录产物按照如下反应体系配制3份，并将配制好的反应体系加入96孔PCR反应板中。

Hieff™ qPCR SYBR® Green Master Mix (No Rox)   10.0ul

Forward Primer  1.0μl

Reverse Primer  1.0μl

模板DNA         X

ddH2O  to 20.0μl

2）PCR扩增

预变性95℃，5min

循环（44次）    95℃→15s，55℃→30s，72℃→20s

熔解曲线75℃→95℃，每20s升温1℃

4、结果处理

ΔΔCT法：

A=CT(目的基因，待测样本)- CT(内标基因，待测样本)

B=CT(目的基因，对照样本)- CT(内标基因，对照样本)

K=A-B

表达倍数=2e-K