荧光定量PCR实验报告-液体类样本
一、实验器材及试剂
1、 实验器材
名称 | 厂家 | 型号 |
多样品研磨珠均质仪 | Omni | Bead Ruptor 12多样品研磨珠均质仪 |
台式高速冷冻型微量离心机 | DragonLab | D3024R |
荧光定量PCR仪 | ABI | 7300 |
超净工作台 | 苏净安泰 | SW-CJ-1FD |
超微量分光光度计 | Thermo | NanoDrop2000 |
标准试剂型纯水仪 | 青岛富勒姆科技有限公司 | FBZ2001-up-p |
离心管 | Axygen Biosciences | |
TIP头 | Axygen Biosciences |
2、 主要实验试剂及耗材
试剂 | 厂家 | 货号 |
RNA提取液 | 武汉赛维尔生物科技有限公司 | G3013 |
三氯甲烷 | 国药集团化学试剂有限公司 | 10006818 |
异丙醇 | 国药集团化学试剂有限公司 | 80109218 |
无水乙醇 | 国药集团化学试剂有限公司 | 10009218 |
HyPure TMMolecular Biology Grade Water | HyClone | SH30538.02 |
RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit | Thermo | #K1622 |
FastStart Universal SYBR Green Master(Rox) | Roche | 04 913 914 001 |
引物 |
75%乙醇:HyPure TMMolecular Biology Grade Water配制
离心管、TIP头均购湿热灭菌40min,干燥。
二、荧光定量PCR实验步骤
1、总RNA抽提(枪头和离心管均经过湿热灭菌,无RNA酶)
1)将血液收集于EDTA抗凝管中,离心取细胞沉淀。
2)取1ml的Trizol Reagent,置冰上预冷,加入到细胞沉淀中。
3)充分混匀摇匀。
4)12000rpm离心10min取上清。
5)加入250 μl三氯甲烷,颠倒离心管15s,充分混匀,静置3min。
6)4℃ 下12000rpm离心10min。
7)将上清转移到一新的离心管中,加入0.8倍体积的异丙醇,颠倒混匀。
8)-20℃ 放置15min。
9)4℃下12000rpm离心10min,管底的白色沉淀即为RNA。
10)吸除液体,加入75%乙醇1.5ml洗涤沉淀。
11)4℃下12000rpm离心5min。
12)将液体吸除干净,将离心管置于超净台上吹3min。
13)加入15μl无RNA酶的水溶解RNA。
14)55℃ 孵育5min。
15)使用Nanodrop 2000检测RNA浓度及纯度:仪器空白调零后取2.5μl 待测RNA溶液于检测基座上,放下样品臂,使用电脑上的软件开始吸光值检测。
16)将浓度过高的RNA进行适当比例的稀释,使其终浓度为200ng/μl.
2、反转录(枪头和PCR均经过湿热灭菌,无RNA酶)
1)取一PCR管,加入含2μg RNA的溶液。
2)加入1μl oligo(dT)18。
3)用无核糖核酸酶的去离子水补足至12μl。
4)于PCR仪上65℃ 保温5min,迅速置冰上冷却。
5)依次加入4μl 5×buffer,2μl 10mM dNTPs,1μl RNA inhibitor和1μl 反转录酶,用枪抽吸混匀。
6)于PCR仪上42℃保温60min,结束后80℃保温5min灭活反转录酶。
3、定量PCR
1)取0.2ml PCR管,配制如下反应体系,每个反转录产物配制3管。
2× qPCR Mix12.5μl
7.5μM基因引物2.0μl
反转录产物2.5μl
ddH2O8.0μl
2)PCR扩增
预变性95℃,10min
循环(40次) 95℃,15s→60℃,60s
溶解曲线75℃→95℃,每20s升温1℃
4、结果处理
ΔΔCT法:
A=CT(目的基因,待测样本)- CT(内标基因,待测样本)
B=CT(目的基因,对照样本)- CT(内标基因,对照样本)
K=A-B
表达倍数=2e-K