一、实验器材及试剂

1、 实验器材

2、 主要实验试剂

二、 OCT包埋

1. 新鲜组织取材后，按实验目的进行修剪。应在离体30min内进行快速OCT包埋。

2. 包埋盒底部滴入OCT，覆盖包埋盒的底部。

3. 将组织放入包埋盒中，根据组织形状调整组织的位置。组织上覆盖OCT，将组织完全覆盖。避免产生气泡。

三、冰冻切片

1. 组织块固定在切片机上，调节冰冻温度调节器，在冷冻台上冰冻组织块。室温停留片刻，再进行切片。

2. 调整切片机刀片到适当的位置和角度，试切出完整连续的切片以确定最合适的条件。

3. 正式切片前应先对组织块修片并暴露出需要的切面。进行快速连续切片，选择合适的切片附贴在载玻片上，并做好标记。

4. 剩余冰冻组织干燥后放入冰冻切片盒中，-80℃避光保存。

四、免疫荧光染色实验步骤

1. 冰冻切片固定：切片从冰箱取出复温20-30min,置于4%多聚甲醛固定30min，于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。

2. 抗原修复：组织切片置于盛满EDTA 抗原修复缓冲液（PH6.0）的修复盒中于微波炉内进行抗原修复。大火3min，停火10min, 转为低火3min, 此过程中应防止缓冲液过度蒸发，切勿干片。自然冷却后将玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。（修复液和修复强度根据组织来确定）。

3. 画圈血清封闭：切片稍甩干后用组化笔在组织周围画圈（防止抗体流走），甩干PBS，滴加5%BSA，封闭30min。（一抗是山羊来源用10%驴血清封闭，一抗其它来源的用5%BSA封闭）。

4、一抗孵育：用PBS稀释一抗到合适浓度，每片滴加100ul一抗，4℃孵育过夜。

5、二抗孵育：切片从冰箱取出复温20-30min,PBST洗涤3次，用1％BSA稀释FITC标记的二抗，每张切片滴加50ul的二抗，37℃烘箱孵育半小时。

6、复染DAPI:PBST洗涤3min*3次，加入稀释好的DAPI,室温孵育10min。

7、封片镜检：每张切片滴加适量的抗荧光淬灭剂盖上盖玻片，荧光显微镜观察，或者全扫仪器全扫。

染色结果：DAPI染核为蓝色的荧光，阳性部位为绿色的荧光。