一、实验器材及试剂

1、 实验器材

2、 主要实验试剂

二、组织石蜡包埋切片实验步骤

1、取材：新鲜组织固定于4%多聚甲醛24h以上。将组织从固定液取出在通风橱内用手术刀将目的部位组织修平整，将修切好的组织和对应的标签放于脱水盒内。

2、脱水：将脱水盒放进吊篮里于脱水机内依次梯度酒精进行脱水。75%酒精1h-85%酒精1h-90%酒精1h-95%酒精1h-无水乙醇I 30min-无水乙醇II 30min-醇苯5-10min-二甲苯I 5-10min-二甲苯II 5-10min-蜡I 1h-蜡II 1h-蜡III 1h。

3、包埋：将浸好蜡的组织于包埋机内进行包埋。先将融化的蜡放入包埋框，待蜡凝固之前将组织从脱水盒内取出按照包埋面的要求放入包埋框并贴上对应的标签。于-20°冻台冷却，蜡凝固后将蜡块从包埋框中取出并修整蜡块。

4、切片：将修整好的蜡块置于石蜡切片机上切片，片厚4μm。 切片漂浮于摊片机43℃ 温水上将组织展平，用载玻片将组织捞起，并放进60℃ 烘箱内烤片。待水烤干蜡烤化后取出常温保存备用。

三、 石蜡切片免疫组化实验步骤

1、 石蜡切片脱蜡至水：依次将切片放入二甲苯Ⅰ15min-二甲苯Ⅱ15min-无水乙醇Ⅰ5min-无水乙醇Ⅱ5min-85%酒精5min-75%酒精5min-蒸馏水洗。

2、 抗原修复：组织切片置于盛满EDTA 抗原修复缓冲液（PH8.0）的修复盒中于微波炉内进行抗原修复。大火3min，停火10min, 转为低火3min, 此过程中应防止缓冲液过度蒸发，切勿干片。自然冷却后将玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。（修复液和修复强度根据组织来确定）

3、 阻断内源性过氧化物酶：切片放入3%过氧化氢溶液，室温避光孵育15 min，将玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。

4、 BSA或者血清封闭:切片稍甩干后用组化笔在组织周围画圈（防止抗体流走），在圈内滴加用5%BSA均匀覆盖组织，室温封闭30min。

5、 加一抗：轻轻甩掉封闭液，在切片上滴加PBS按一定比例配好的一抗，切片平放于湿盒内4°C孵育过夜。（湿盒内加少量水防止抗体蒸发）

6、 加二抗：玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后在圈内滴加组化试剂盒内与一抗相应种属的二抗（HRP标记）覆盖组织，室温孵育50min。

7、 DAB显色：玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后在圈内滴加新鲜配制的DAB显色液，显微镜下控制显色时间，阳性为棕黄色，自来水冲洗切片终止显色。

8、 复染细胞核：Harris苏木素复染5min左右，自来水洗，1%的盐酸酒精分化数秒，自来水冲洗，PBS返蓝，流水冲洗。

9、 脱水封片：将切片依次放入75%酒精1min-85%酒精1min --无水乙醇Ⅰ6min -无水乙醇Ⅱ6min -二甲苯Ⅰ30min 中脱水透明，将切片从二甲苯拿出来稍晾干，中性树胶封片。

10. 显微镜镜检，图像采集分析。

四、 石蜡切片免疫组化结果判读

苏木素染细胞核为蓝色，DAB显出的阳性表达为棕黄色。