脓毒症动物模型实验报告
脓毒症（sepsis）是指由感染引起的全身炎症反应综合征（Systemic inflammatoy response syndrome，SIRS），临床上证实有致病菌侵袭存在或有高度可疑的感染性病灶，临床中多以常见并发症出现在重度感染、大面积烧伤、严重创伤或大手术术后的危重患者当中。脓毒症一旦发生，进展迅速，短时间可由全身炎性反应综合征（Systemic inflammatory response syndrome，SIRS）、脓毒症进展为重度脓毒症（severe sepsis）（合并器官功能不全）、脓毒症休克（septic shock）（并发充分液体复苏亦无法纠正的低血压）及多器官功能障碍综合征（Multiple organ dysfunction syndrome，MODS），以上三者可贯序发生，亦可同时发生，严重危及患者生命，产生极高的致死风险。虽然目前已经有许多动物模型用来复制脓毒症，但盲肠结扎穿孔术（CLP）致脓毒症的啮齿动物模型仍然是目前应用最广泛的脓毒症动物模型。
1 实验材料
SPF级雄性Wistar大鼠，250~300g
乳酸检测试剂盒、IL-6，IL-10，HMGB1 试剂盒
2 实验分组
（1）假手术组：大鼠剖腹后仅分离盲肠远端后关腹，不结扎穿孔盲肠，术后观察1h，适当地给予大鼠取暖器加热维持大鼠肛温在37℃~38℃(复温过程要缓慢，至少要2h)，继续培养至术后24h（标记为A组）；
（2）38℃组：大鼠CLP术后观察1h，然后适当地给予大鼠取暖器加热维持大鼠肛温在37℃~38℃(复温过程要缓慢，至少要2h)，继续培养至术后24h（标记为B组）；
（3）34℃组：大鼠CLP术后观察1h，术后维持大鼠肛温在37℃~38℃ T1小时后，用冰袋进行外部冷却，在15min内使小鼠肛温降至并维持在34℃左右，低温介入X h，然后用取暖器复温至肛温在37℃~38℃(复温过程要缓慢，至少要2h)，继续培养，使术后的总培养时间为24h（标记为C组）。
3 大鼠CLP模型的构建
（1）称量大鼠，腹腔注射水合氯醛（350mg/kg）麻醉，腹部正中剃毛后用碘酒及酒精擦拭手术区域。
（2）沿腹白线切开腹腔约50px，找出盲肠，用 5-0 缝线结扎约1/3盲肠，以21G针头贯通穿刺结扎的盲肠2次。轻轻挤压使少量肠内容物从穿刺孔溢出确保通畅；将处理好的盲肠回纳入腹腔，用 5-0 缝线缝合内层，3-0缝线缝合外层，皮下注射生理盐水2ml/100g补充体液。
4 样本的采集
记录38℃组动物的生存时间并绘制生存曲线，于CLP术后0、3、6、9、12、24h收集血液样本，24h后消毒胸腹部，严格准守无菌操作原则，对大鼠进行剖腹手术，收集小肠（于距盲肠125px处，无菌切取小肠组织），剖胸取肺脏，部分组织新鲜组织用于检测肺W/D，部分组织冻存于-80℃冰箱待用，部分于10%中性福尔马林固定液中固定待用。
5 低温介入时间点（T1）确定
假手术组和38℃组于术后0、3、6、9、12、24h收集血液样本，用Elisa试剂盒检测血液样本中IL-6，IL-10的含量，将炎症因子开始上升的时间点记为T1,开始上升到峰值的时间段记为X h。实验结果见 ，结果表明炎症从3h开始就显著上升，至12h为峰值，故T1为3h，X=9h。
6 肺组织湿干重比W/D检测
取新鲜右肺组织，纱布吸干表面及肺组织中的血液，精确称量湿重，至于65°恒温箱（上海精宏实验设备有限公司，PHG-9070A）中24h至恒重，再一次精确称量干重（W/D=肺湿重/干重）。
7 小肠病理学检测
对上述三组动物的小肠进行HE染色，将组织切片于200倍视野下选取5个随机区域，进行肠粘膜病理观察和肠粘膜上皮损伤指数分析。
8 肺病理学检测
对上述三组动物的肺组织样本行HE染色后，光学显微镜下观察肺组织病理学变化。
9 肺组织中HMGB1的检测
用Elisa试剂盒检测上述三组动物CLP术后24h收集的肺组织样本中HMGB1的含量。
10 血液细菌感染程度检测
取上述三组动物CLP术后24h收集的血液样本，各取50ul均匀涂板（LB固体平板），37℃细菌培养箱（上海精宏实验设备有限公司，DNP-9162）过夜培养后，拍照，计算出每毫升血液所含的菌落数（CFU），反应CLP模型小鼠全身细菌感染严重程度。
11 血液样本中血乳酸及IL-6，IL-10和HMGB1的含量的检测
取上述三组动物CLP术后0、3、9、12、24h收集的血液样本中乳酸及IL-6，IL-10的含量，用试剂盒检测上述三组动物CLP术后12、24h收集的血液样本中HMGB1的含量。
12 Western Blot检测血液样本中p-p65、p65的蛋白含量
用Western Blot检测三组动物CLP术后12、24h收集的血液样本中p-p65、p65的蛋白含量，以GAPDH为内参。