Western Blot 实验报告
一、实验材料
名称 | 厂家 | 货号 |
组织裂解液 | 武汉云克隆科技股份有限公司 | A101 |
BCA总蛋白定量测定试剂盒（微孔板法） | 武汉云克隆科技股份有限公司 | A202 |
过硫酸铵 | 国药集团化学试剂有限公司 | |
电泳缓冲液 | 武汉云克隆科技股份有限公司 | A421 |
TEMED | 上海阿拉丁生化科技有限公司 | C1805063 |
丙烯酰胺 | 国药集团化学试剂有限公司 | 800013290 |
SDS上样缓冲液 | 武汉云克隆科技股份有限公司 | C0301 |
PVDF膜 | 美国Millipore | |
ECL发光底物 | 上海翊圣生物科技有限公司/Yeasen | 36208ES76 |
显影液 | 武汉云克隆科技股份有限公司 | B0601 |
定影液 | 武汉云克隆科技股份有限公司 | B0602 |
X光胶片 | Carestream/锐科医疗器械有限公司 | XBT |
水平摇床 | 其林贝尔仪器制造有限公司 | 型号TS-1 |
离心管 | 武汉永嘉仪器仪表有限责任公司 | |
移液器 | Dragonlab大龙兴创实验仪器有限公司 | |
电泳仪电源 | 北京六一生物科技有限公司 | DYY-7C |
迷你电泳槽 | 北京六一生物科技有限公司 | DYCZ-24DN |
冷冻离心机 | 美国Sigma | 3K15 |
湿转转印系统转印槽 | 北京君意东方电泳设备有限公司 | JY-ZY5 |
半干转印系统转印槽 | BIO-RAD/美国伯乐 | M1703940 |
扫描仪 | 日本Canon/佳能 | 5600F |
酶标仪 | BioTek/美国伯腾仪器有限公司 | ELx808 |
二、实验步骤
1.制备蛋白样品：
组织总蛋白样品制备
（1）取适量组织块，在预冷PBS（0.01mol/L， pH=7.0-7.2）中清洗去除血液，匀浆前先称并记录重量。
（2）在冰盒上将组织剪成小块，加入预冷的新鲜裂解缓冲液。按照质量体积比=1:20加入组织裂解液
（裂解液配方：含有终浓度5mM EDTA，2mM PMSF 的1% SDS，PMSF临用前加入）
（3）使用高速分散匀浆机，探头速率18000rpm，冰上匀浆30s。（匀浆时间依据样本特性而定，但必须保证同批同种样本匀浆时间一致。）
（4）将制备好的匀浆液10,000转4℃离心5分钟，弃沉淀，上清即可用于检测或置于-20℃下保存。
细胞总蛋白样品制备
（1）准备所需细胞，贴壁细胞用胰酶消化，无菌PBS1500转4℃离心3min，共清洗两次。
（2）每10×7个细胞加1000ul SDS裂解液，加入PMSF(终浓度1mM)冰上裂解，摇床震荡10min。如未完全溶解可短时超声1min左右。
（3）将裂解液10000转4℃离心5min，取上清-20℃保存备用。
2.蛋白定量：
BCA法测定总蛋白含量：用酶标仪在562nm处测定吸光值，计算出每例样品中的总蛋白含量。
3.制样：
（1）取400ul的蛋白上清液，加入100ul 5×SDS上样缓冲液 (Tris 300mmol/L，SDS 8%，溴酚兰 1%，甘油 50%，浓盐酸调pH到6.8)
（2）每例样品中补加 1×SDS上样缓冲液,使得每例样品中的总蛋白含量一致。
（3）煮样：混合后沸水中煮5min；
4.SDS-PAGE跑胶：
（1）准备：将玻璃板去污剂充分洗涤，自来水、蒸馏水冲洗，晾干。将玻璃板装入胶架，固定在垂直电泳槽上，待用。
（2）分离胶的配制：
根据目的蛋白分子量大小选择合适的分离胶(即下层胶)浓度，具体选择依据参照表一：
表一： 分离胶浓度选择参考表（以5mL为例）
浓度度 体积 成份 | 蒸馏水 | 30%胶母液(29:1) | 分离胶缓冲液 | 10%过硫酸铵 | TEMED | 最佳分离范围 |
8%胶 | 2.45 | 1.3 | 1.25 | 0.05 | 0.003 | 80-200kD |
10%胶 | 2.05 | 1.7 | 1.25 | 0.05 | 0.002 | 30-90kD |
12%胶 | 1.75 | 2.0 | 1.25 | 0.04 | 0.002 | 12-60kD |
15%胶 | 1.25 | 2.5 | 1.25 | 0.04 | 0.002 | 10-40kD |
待分离凝胶完全后（约30分钟），弃覆盖层液体。尽可能排尽凝胶上的液体，再用滤纸片小心吸尽上层残留液体。注：10%过硫酸铵和TEMED最后加入；TEMED一旦加入，在充分混合后应立即进行下一步骤。加入混合好的凝胶混合液时注意不能存留气泡；随后加入1ml左右的异丁醇进行封胶，赶走气泡，压平分离胶，并防止氧气进入凝胶而抑制聚合反应。
（3）配置5%浓缩胶
表二： 浓缩胶的配置配方（以3mL为例）
浓度度 体积 成份 | 蒸馏水 | 30%胶母液(29:1) | 浓缩胶缓冲液 （PH 8.8） | 10%过硫酸铵 | TEMED |
5%浓缩胶 | 2.1 | 0.5 | 0.38 | 0.03 | 0.003 |
注：预先准备好15孔的电泳梳子，洗干净后晾干。10%过硫酸铵和TEMED最后加入；TEMED一旦加入，立即进行下一步骤：在已经聚合的分离胶上直接灌注浓缩胶，并将梳子一头倾斜、小心插入灌满浓缩胶的垂直玻璃板间隙，将胶垂直放置在室温30分钟以完全聚合。
（4）电泳
取出制备好的样品，先取出放置常温，每孔加入10ul的样品。80V的电压下电泳至染料进入分离胶后（约30分钟），将电压增加到150V直至染料到达分离胶底部（约60分钟），终止电泳。
5. 转膜
（1）取下分离胶并于转膜 buffer 中浸泡 10min 左右。
（2）转膜：准备PVDF膜，用时先放在甲醇中活化15秒左右，然后浸泡于 Transfer buffer。将滤纸、分离胶、PVDF膜叠成三明治。即阳极→海绵→下层滤纸→膜→凝胶→上层滤纸→海绵→阴极。（组装前，滤纸、海绵要在转膜 buffer 浸泡；组装时要注意不要夹入较大气泡）
⑶ 转移：电泳装置于冰中，250mA 电流下转膜。根据分子量大小，湿转2~3h左右。
6. 目的蛋白的免疫检测
（1）特异抗体与抗原的结合
将PVDF膜浸于封闭液（5%脱脂牛奶溶于PBST）室温1小时或4℃过夜；
（PBST： PBS pH 7.5， 0.1% Tween 20）
PBST摇床震荡洗涤3分钟×2次；
37℃一抗孵育120min（水平摇床），抗体使用浓度参考说明书；
PBST摇床震荡洗涤3分钟×2次；
37℃ 二抗（云克隆）孵育60min（水平摇床）；
PBST摇床震荡洗涤3分钟×2次。
（2）显影
将PVDF膜正面向上平铺于一平皿内，将化学发光底物（A液200ul+B液200ul+纯水1.2ml混匀）加于PVDF膜上，于暗室中孵育约1分钟，即可见发光的杂交带；弃去发光底物，用Parafilm膜包裹PVDF膜，将PVDF膜置于已备好的数张与膜大小相等的X光胶片之间，置入附设的增光屏的暗盒中；曝光约1-3分钟，每隔一分钟取出一张Ｘ光胶片，显影5分钟，定影5分钟，水洗10分钟以上，晾干。