碱性磷酸酶染色实验报告
一、实验器材及试剂
1、 实验器材
名称 | 厂家 | 型号 |
包埋机 | 浙江省金华市科迪仪器设备有限公司 | KD-BM |
病理切片机 | 浙江省金华市科迪仪器设备有限公司 | KD-2258 |
摊片机 | 浙江省金华市科迪仪器设备有限公司 | KD-P |
冻台 | 浙江省金华市科迪仪器设备有限公司 | KD-BL |
烤箱 | 上海精宏实验设备有限公司 | PHG-9070A |
载玻片及盖玻片 | 江苏世泰实验器材有限公司 | 10212432C |
正置光学显微镜 | 日本奥林巴斯 | OLYMPUS CK31 |
成像系统 | 明美Mshot | TVO.63XC-MO |
数字全扫仪器 | 3DHISTECH | Pannoramic SCAN |
脱水机 | 武汉俊杰电子有限公司 | JJ-12J |
2、 主要实验试剂
试剂 | 厂家 | 货号 |
无水乙醇 | 国药集团化学试剂有限公司 | 10009218 |
二甲苯 | 国药集团化学试剂有限公司 | 10023418 |
碱性磷酸酶染色液 | 索莱宝 | G1481 |
PBS | 武汉云克隆科技股份有限公司 | B006 |
乙二胺四乙酸二钠 | 国药集团化学试剂有限公司 | 10009718 |
二、组织石蜡包埋切片实验步骤
1、取材：新鲜组织固定于4%多聚甲醛24h以上。
2、脱钙：将福尔马林固定好的骨组织，置于20倍体积的10%EDTA脱钙液（EDTA(乙二胺四乙酸二钠）50g，PBS缓冲液 500ml，溶解后用NAOH调PH值到 7.2-7.4）中，放入37度水浴中，3天左右应该更换脱钙液一次，待骨组织可以轻松用针刺入，表面脱钙完全。可将组织从固定液取出在通风橱内用手术刀将目的部位组织修平整，将修切好的组织和对应的标签放于脱水盒内。
3、脱水：将脱水盒放进吊篮里于脱水机内依次梯度酒精进行脱水。75%酒精1h-85%酒精1h-90%酒精1h-95%酒精1h-无水乙醇I 30min-无水乙醇II 30min-醇苯5-10min-二甲苯I 5-10min-二甲苯II 5-10min-蜡I 1h-蜡II 1h-蜡III 1h。
4、包埋：将浸好蜡的组织于包埋机内进行包埋。先将融化的蜡放入包埋框，待蜡凝固之前将组织从脱水盒内取出按照包埋面的要求放入包埋框并贴上对应的标签。于-20°冻台冷却，蜡凝固后将蜡块从包埋框中取出并修整蜡块。
5、切片：将修整好的蜡块置于石蜡切片机上切片，片厚4μm。 切片漂浮于摊片机43℃ 温水上将组织展平，用载玻片将组织捞起，并放进60℃ 烘箱内烤片。待水烤干蜡烤化后取出常温保存备用。
三、 甲苯胺蓝染色实验步骤
(一)石蜡切片染色.
1.石蜡切片脱蜡至蒸馏水。
2. 切片入ALP孵育液中，37°C孵育2-12h。 流水洗2min， 入蒸馏水。
3. 入试剂B中，37°C孵育5min。 流水洗5min后，入蒸馏水。
4.在上述过程中， 配制硫化工作液，即取试剂(C)用蒸馏水或者去离子水稀释50倍,即为硫化工作液，即配即用。切片入硫化工作液，孵育1-2min。流水洗10min，入蒸馏水。
5. (可选)核固红复染细胞核，蒸馏水洗。
6. 石蜡切片常规脱水、透明，树胶封片。
(二)冰冻切片染色
1.冰冻切片在丙酮-氯仿等量混合液内，4C固定2-5min。
2. 切片入ALP孵育液，37°C孵育45-75min。 流水洗2min，入蒸馏水。
3. 入试剂B中，37°C孵育5min。 流水洗5min后，入蒸馏水。.
4.在上述过程中，配制硫化工作液，即取试剂(C)用蒸馏水或者去离子水稀释50倍,即为硫化工作液，即配即用。切片入硫化工作液，孵育1-2min。流水洗10min，入蒸馏水。
5.(可选)核固红复染细胞核，蒸馏水洗。
6.冰冻切片用甘 油明胶封片。
染色结果:
酶所在阳性部位：黑色硫化钴沉淀
细胞核：红色(核固红复染)